Herstellung und Etablierung von 4-Hydroxytamoxifen aktivierbaren PKC\(\alpha\)-, PKC\(\beta\)1- und PKC\(\delta\)-Fusionsproteinen
- Die Proteinkinase C (PKC) besteht aus einer Familie von 11 Isoenzymen (IE). Zur genaueren Charakterisierung der Wirkung der PKC-IE, wurden 4 Hydroxytamoxifen induzierbare PKC-Fusionsproteine (PKC-FP) hergestellt. Die katalytische Domäne der PKC\(\alpha\), \(\beta\)1 und \(\delta\) wurde mit dem mutierten Östrogenrezeptor fusioniert und in die pcDNA3.1/HisB subkloniert. Die Expression wurde für alle drei FP nachgewiesen. Die Funktionalität des PKC\(\beta\)1-FP ist aufgrund des Nachweises einer Mutation mittels Sequenzanalyse fraglich. Die Enzymaktivität wurde im Phosphorylierungsassay für das PKC\(\alpha\)- und PKC\(\delta\)-FP in vitro nachgewiesen. Im dualen Luciferase-Assay wurde die PKC-abhängige Aktivierung und Hemmung des MAPK-Signaltransduktionsweges über ERK1/ERK2 in vivo gezeigt. Als Schlüsselenzym für die Signaltransduktion spielt die PKC u.a. eine Rolle beim Diabetes mellitus und seinen Folgeerkrankungen. Die hergestellten und etablierten FP können in weiteren Experimenten neue isoenzymspezifische Erkenntnisse ermöglichen.
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